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发布时间:2020-07-28
一种新型复合微生态造剂的研造_农学_上等培植_培植专区。一审盟 国置Q f?}|w{DⅧY mUs讯Y 一种新型复合微生态造剂的研造 傅金衡,魏华,孙红斌,许杨,章仕兴,袁勇芳 (中德撮合探索院,江西南昌330047) 摘要:采用双歧杆菌、蜡样芽孢   一审盟 国置Q f?}|w{DⅧY mUs讯Y 一种新型复合微生态造剂的研造 傅金衡,魏华,孙红斌,许杨,章仕兴,袁勇芳 (中德撮合探索院,江西南昌330047) 摘要:采用双歧杆菌、蜡样芽孢杆菌及低聚果糖造成~种新型复台微生态造刑,正在温度25℃、干燥前提下其活茜 胀维系基末安靖的工夫为12个月,毒理尝试注解其安闲无毒, 美键词:微生态造剂;鼠歧杆菌;蜡样芽袍杆菌;低聚果糖 中图分类号:TS252 4 文件标识鹤:^ 著作编号:l(}0I一2230(2001)ol—OOf6—04 Study on the novel complex micrOecolOgical preparation FU fin—heng,WEI Hua,SUN Hong;-bin;XU Yang,ZHANG Shi—xing,YUAN Yong和ng JiangxitOM Joint Research[nstitute,Nanchang 330047.China) Abstract:The making posed of method of a novel complex microecological preparation is was introduced,il is at COIII, Bifidobacterium.BaciYus Cereus and bifiduslactor.and its stable phase least 12 months Key words:microecological preparation;Bifidobcu:terium;Bacillus Cereus;ffuetan 0幼序 微生态调治剂一问世便受到了人们的多数迎接, 并以惊人的速率、优秀的成绩被更多的人承受,其理由 是该调治剂正在人类的保健和防治疾病中阐明着紧张的 感化。双歧杆菌是近年来正在学术界探索微生态学并成 功用于贸易化的一种肠道有益菌,它与人体的健壮密 切相干,正在1 990年日本东京召开的双歧杆菌国际学 术协商会上,极少与会专家对双歧杆菌与人体健壮的 联系作出如下评判:人的肠道内双歧杆菌数方针多寡 直接与人类发育、健壮、智商和龟龄精密相干.况且很 恐怕成正比联系。 双歧杆菌是一种厌氧菌.它对存在处境的恳求非 常苛刻,易受氧、水分、光彩、保卫基质等前提的影响。 目前墟市上的大无数双歧杆菌产物活菌量很低,生存 不到1个月。 蜡样芽孢杆菌通过其吸氧本领,低落肠腔内氧化 还原电位,鼓吹寻常菌群中的厌氧菌成员成长和繁 殖‘。“,, 收稿目期:2000~05—28 基金项目江西省教委兴盛资金课题 作家简介:溥盒鸯(1970一),判,讲师.∥f究宗旨为食物}援生物。 2001年第19卷第1期(总第140期) 万方数据 低聚果糖可拔取胜增殖双歧杆菌,被双歧杆菌代 谢后会出现醋酸及乳酸,使肠道呈酸性,抑低无益菌的 i.i 3分手提拔 样品稀释一i峰E分手一单菌落一活化2次一生存菌种。 增殖,鼓吹肠道的蠢动.还拥有捌节人体免疫力,低落 血脂等多种紧张心理功用o“1。 本探索凭借微生态道理,诈骗蜡样芽孢杆茁酿成 体内厌氧处境、双歧因子鼓吹双歧杆菌成长,再加强补 充双歧杆菌来成立微生态平均,防备和调养抗生索的 副感化2。“。 ,,.4判决 按照相闭文件,考察细菌正在拔取性平板上的茁落形 态特色、菌体状态特色、革兰氏染色性状,再举行属和种 的心理生化特陛辨别试验,用色谱法举行代谢产品判辨。 1 2双歧杆菌、蜡样芽胞杆菌的发酵 菌种一试管一250 mL三角瓶一5L自愿发酵罐一 1原料与形式 1.1菌种的分手、提拔及判决”8 1.1 测定菌量、酸度和pH值。 三角瓶装液量为100mL,接种量为5%.同化气为 l菌种 双歧杆菌B:,中德撮合探索院生物工程室分手。 N2:COd=90:10,透风量每分钟为n5~l_0 WI/。 1 3新型复台微生态造剂的造备 从易于工业化临盆的角度研究,应拔取正在乳中易于繁 殖、耐氧本领强、耐酸本领强的菌株。正在生存的4株菌 株中,挑选了成长速率速,耐酸本领强的B,菌株;以产 酸凝乳时I司为特色目标.将原始菌株接人复兴乳中测 定凝乳工夫,再将复筛开拔菌株接入发酵提拔基,正在温 度37℃下厌氧提拔24 h,按期反省活菌量及pH值。 结果注解,B,菌株易于滋生、耐酸本领强,有:【业化生 声的潜力。 因为有些蜡样芽孢杆菌能出现肠毒素.笔者分手 了1株无毒蜡样芽胞杆菌D。九州体育BET水产物微生态造剂是什么肠。肠道微生态造剂含有哪种细菌 i.1.2培奏基 复兴乳:10%脱脂乳,双歧杆菌成长因子1%,温 度113℃,工夫15 5,酵母浸膏粉0 mitt。 ,3.』苗粉的造备 工艺流程: 提拔基 I 灭菌 茵种 J 一级种子 =级种子 冷却 ,接种一发酵一离m一菌泥一 一加保卫剂一真空冷;§干燥一菌粉 工艺证明及枢纽左右点: 双歧杆菌拔取性提拔基(%):卵白胨l 5,水产物微生态造剂是什么葡萄糖 1 <臃期检测发酵液的酸度、pH值,确定发酵止境 正在对数成长远的前期,以利于细菌活性的维系。 4,NaCl 0 5,Na,HP04 0 25,硫代 乙醇酸钠0 1,L.半胱氨酸0.I.琼揩2,牛肉汤50 rnL,肝汤50 mL.10i-t值为7 5,温度121℃,时问20 min。灭菌后冷却至55℃安排,参加5%~6%的无菌 兔血或羊血,混匀造成平板,备用。 双歧杆菌液体提拔基(%):卵白胨1.5.葡萄糖 1 ②发酵液离心重降应采用低温、道微生态造剂含有哪种细菌肠道暮年人天山奇高速、短时。 ③离心所得菌泥应参加适量保卫剂,变成高浓度 悬浮菌液,敏捷冻结至一50℃。 ④冷冻干燥应正在5 min内压力抵达66.5 Pa,随后 降至20 Pa,自此可恰当加温,预防不要捣鬼共融点,以 使样品维系冻结形态。 ⑤干燥水分应左右正在2%以内,不然会影响双歧 杆菌的生存工夫。冻干后的菌粉举行真空包装后低温 储存备用。 5,酵母浸膏粉0.4.Na,C1 0.5,NaHPO。0 25,硫代 乙醇酸钠0.1,L~半胱氨酸0 1,牛肉汤50 mL,肝汤 min。 7,微生态制剂使用 50ml,pH值为7 5,温度121℃,工夫15 蜡样芽孢杆菌肉汤提拔基(%):胰酪卵白胨1 大豆胨0 3,氯化钠0 5,磷酸氧二钾O.25,葡萄糖 0 ,,2干燥菌粉的检测 活菌数的检测:采用平板法(称取1 g干粉参加 9 mL 25,多粘菌素B适量,pH值为7.1~7.3。 蜡样芽孢杆菌拔取性提拔基(%):卵白胨I,牛 PBS液融化,然后10倍稀释)。 含水量测定:菌粉正在105℃烘干4 h前后再称重, 肉浸膏0 1,甘露醇1.氯化钠1,卯黄液和多粘菌素B 适量,pH值为7 0~7.2。 估计出干粉中的古水量。 ~㈨现川删m…。。,☆ 万方数据 1 3 3造品造备 双歧杆菌苗粉、肠道微生态造剂晚年人蜡样芽孢杆菌菌粉、双歧因子按一 0.4 24 mL心理盐水悬浮灌胃,逐日1次连灌lO天,停灌 h后,颈椎脱臼正法1/2,幼鼠取心、肝、脾、肺、肾作 定比例同化,参加辅剂,平均搅拌成同化物料,无菌操 作分装胶囊,每粒含同化菌粉200 mg,总菌数为 10 8 机闭病理学反省。 1.5菌粉生存尝试 正在温度25℃、干燥前提下对菌粉的活菌数举行了 12个月的跟踪测定。 g一,m 100粒胶囊瓶装或密封塑料袋装即为新型微 生态造刺造品。 1 4毒性尝试 ,4,试验用幼白鼠 为紧闭群KM幼鼠,体重18~22 g,均为1级动物 t及格证弓:医动学第021-9602)。 ,4 2结果与协商 2.1双歧杆菌 2.J.J状态学考察 正在双歧杆菌拔取性辨别平板上,厌氧前提下37℃ 提拔48 h,菌落直径1~2 mill,突出、边齐、乳白色、不 2测定形式 急性毒性尝试(幼鼠腹腔打针法):选健壮幼鼠随 机分为6组(1~5为尝试组,6为比照组),每组lO只 幼鼠一由预试验确定1~5组的攻击用的活菌量按等 比级数以0 4 透后,有光泽、质地软。经革兰氏染色后呈阳性反映, 正在适宜提拔基上提拔后.菌体呈棒状、弯曲、r、y字形 等,分叉明白,展现双歧杆菌特有的状态。 2.,.2生化反映特色 试验结果如表1,九州体育BET!表2所示。 表1菌株B:的生化判决特色 mL心理盐水稀释折柳1次注入腹腔;对 照组只注入心理盐水0.4 mL。正在室温喂养考察,累计 72 h内的幼鼠去逝数,算出LD。剂量。 亚急性毒性尝试(灌胃法):选健壮幼鼠30只,随 机分为3组.每组lo只,试验前折柳称量体重。给药 途径为灌胃,大剂量组3 mg/mL.含蜡样芽孢杆菌 1 26×10 8 5 mL‘÷,双歧杆菌1.5×10 mL~;幼剂量组用 量为大剂量组用的l/10。对试验I~2组幼鼠,以 表2菌株B,的糖发酵特色 按照表I、表2试验结果可知,B:菌株的特色与双 歧扦菌属的两歧双歧杆菌(占∞dobacterlttm bifidum) 生化特色相符。 2 l 2 2蜡样芽孢杆菌 2.2,』蜡样芽孢杆菌D,的生物学性状 苗体形式,长宽比约为4,两头钝圆,两侧平行,菌 3代谢产蝴判辨 判辨厌氧菌对葡萄糖终端代谢产品,是厌氧菌分类 体单个或成短链状罗列,举止赶速,革兰氏染色阳性, 正在生芽孢提拔基或MYP上提拔24 h,可见豪爽游离芽 孢,也有片面正在养分体中,或正在残破不全的养分细胞 中。芽孢居菌体中部,不超过菌体,成钝卵形,长约 菌体的1/4~1/3,菌体无荚膜,有鞭毛。 2.2.2蜡样芽孢杆菌D。的心理化特色 判决的紧张凭借之一。双歧杆菌的的闭键终端产品是醋 酸和乳酸,其醋酸与乳酸摩尔比为2:1或3:2。 将B:菌株接人葡萄糖提拔基,厌氧提拔48 h后, 离心除去菌体(转数8 000 r/rnin,工夫10 min),取上 清液用CHROMPACK公司气相色谱仪检测,结果表 明、B:菌株出现醋酸和乳酸,其比值约为3:2。天山奇微生态造剂适应 双歧杆菌的代谢特色。 能发酵葡萄糖、产气、产酸.VP反映阳性;能水解 酪卵白、酪氨酸,能液化明胶、还原硝酸盐;正在7%NaC[ 液或0.001%溶菌酶肉汤中能成长,有动力;触酶反 应、卵黄反映、MR反映均为阳性;不行正在甘露醇中产 从状态学,生化反映、代谢产品的试验结果来看, 菌株B,可判决为两歧双歧杆菌。 酸;正在葡萄糖琼脂上不行成长;兼性厌氧;能水解马铃 ☆!㈣铺:嘴引蚍艨140㈣ 万方数据 薯淀粉,能正在柠檬酸盐琼脂上产碱。 按照以上结果,D,适应蜡样芽孢杆菌特色。 2 比力安靖,有利于本造剂正在种种处境下的生存和运输。 3毒性尝试结果 急性毒性试验:折半致死量(LD。)为 m吕/kg(订正寇法估计)。 8 8 8 6 8 4 8 2 8 0 7 8 7.6 7 4 0 2 4 6 8 10 12 1】0.4 亚急性毒性试验:大、幼剂量组用药后与比照组 (灌心理盐水)比力,体重、毛色、举止情状无明白差 异,血惯例反省各项目标均寻常。心、肺、肝、肾、幼肠 的肉眼考察及病理反省未挖掘特殊。 以是,按照毒性试验已发端表明这种微生态造剂 是一个安闲的活菌造剂。 2 I/月 图2蜡样芽孢杆菌安靖性试验 4双歧杆菌菌粉安靖性尝试 双歧杆菌的利用远景很大,但它取决双歧杆菌菌 3完毕语 (1)采用状态考察.生化判决和代谢产品判辨等 尝试伎俩,从对象菌株中判决出双歧杆菌及蜡样芽孢 杆菌。 (2)对双歧杆菌及蜡样芽孢杆菌的发酵功能举行 比力尝试,折柳确定了一株成长速率速、耐酸本领强、 菌体生机强、产率高的菌株。 (3)发酵提拔得到菌体.冷冻干燥后成菌粉,按胶 囊产物的恳求,造成微生态造剂。 (4)毒性尝试注解安闲无毒。 (5)正在温度25℃前提下该微生态造剂活菌数保 持根本安靖的工夫为12月以上。 跟着微生态学的振起和兴盛,通过漏整人体微生 态来鼓吹人体健壮的看法已渐渐被人们承受,微生态 造剂的利用必将尤其平常。 参考文件 [I]康白微生态学[M:大连:大连出书}t.1988,3-52 【2]杨景云医用微生志学[M]北京:?p国医药科技出书社,1997 108—125 粉的存活率和存活期。 正在温度25℃干燥前提下对双歧杆菌的活菌数进 行跟踪测定的结果如图1所示(图1中的纵坐标值为 对数值)。 从图1可能看出,正在温度25℃、干燥前提下活菌 数维系根本安靖的工夫为12个月以上。其理由正在于: ①采用优化组合的配方,增加恰当的双歧杆菌鼓吹生 长因子.使双歧杆菌的产率进一步升高,并使该菌的衰 亡速率明白削弱,大大耽误菌体的存活期;②采用优秀 的冷却干燥工艺.使活菌处于歇眠形态,有帮于生机的 维系,一朝复水后,细菌收复兴有代谢式样.感化于人 体肠道;③正在细菌冻干前参加恰当的保卫剂,使菌体正在 冷冻进程中避免冰晶对其强大的毁伤,从而升高存活率。 [3]付弹.冉陆.李志钢,等低聚果糖调治肠道茁群感化的探索 0 2 4 6 8 10 12 ‘/月 !J].中国食物卫生杂志,1998,10(5):3—6 [4]盒其荣低聚糖及根霉低壤槠的心理功用[J]食物科学,1994, 围1 5 双歧杆菌增加剂安靖性试验 [5] 169(1):5—7. 2蜡样芽孢杆菌菌粉安靖性尝试 陈婷梅微生态造剂-滔菌造刺近况【J]中同微生志学杂志, 1992.4(1):36—40 正在温度25℃、干燥前提下对蜡样芽孢杆菌的活菌 数举行跟踪测定的结果如图2所示(图2中的纵坐标 值为对数值)。 从图2可能看出,正在温度25℃、干燥前提下活菌 数维系根本安靖的工夫为12个月以上。其理由正在于 蜡样芽孢杆菌有芽孢,芽孢对表界的造止力强,活菌数 :6]卢行安,蒋寒青.康白.等对双歧杆菌DM9227株的尝试探索 [J:中国微生态学杂志.1993,5(2):37—41 [7] 许本发,土艳平,腺莹,等耐氧取歧杆菌的分手和判决[J]微 生物学报,1994,34(1):47—49 [8]熊德蠡l临床j)芒氧菌搜检手册CM]北京:中困科学技巧出书 社.1994 2—96 Vol 29,No 1 2001(total 14D ☆ 万方数据